Федеральное агентство по здравоохранению и социальному развитию
Государственное образовательное учреждение
высшего профессионального образования
МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕДИКО-СТОМАТОЛОГИЧЕСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ
Кафедра патофизиологии лечебного факультета
Филатов О.Ю., Малышев И.Ю.
клеточные биотехнологии в ЭНДОКРИНОЛОГИИ
Учебное пособие для студентов лечебного факультета и слушателей факультета последипломного образования
Москва 2010
СОДЕРЖАНИЕ стр.
АННОТАЦИЯ
|
3
|
Часть 1. Биотехнология получения гормонов
|
5
|
Глава 1. Синтез инсулина. Технология рекомбинантной ДНК
|
5
|
Глава 2. Рекомбинантный фоллитропин
|
31
|
Глава 3. Рекомбинантный гормон роста
|
37
|
Часть 2 Биотехнология использования клеток в терапии
|
39
|
Глава 1. Диабет и клеточная трансплантация
|
39
|
Глава 2. Диабет и стволовые клетки
|
47
|
Глава 3. Трансфекция (перенос) гена человеческого инсулина с глюкозочувствительным промотором в неинулинпродуцирующие клетки с последующей аутологичной их трансплантацией
|
56
|
Часть 3. Перспективы биотехнологии. Топологическая концепция создания биоискусственных органов на примере щитовидной железы
|
59
|
Список литературы
|
65
|
РАБОЧАЯ ТЕТРАДЬ
|
66
|
КОНТРОЛЬ ЗНАНИЙ
|
75
|
Аннотация: Учебное пособие посвящено использованию современных методов клеточных биотехнологий в эндокринологии, и предназначено для методического обеспечения инновационно-образовательной деятельности медицинского ВУЗа. Учебное пособие предназначено для студентов, аспирантов и научных сотрудников медицинских ВУЗов. В представлен вклад биотехнологии в развитие эндокринологии и, прежде всего, создание генно-инженерных лекарственных препаратов: гормонов (инсулин, гормон роста), рекомбинантных гонадотропинов. К последним можно отнести рекомбинантный фоллитропин, применяющийся для гиперстимуляции яичниов при лечении бесплодия, и другие гормоны половой сферы. Современные достижения генной инженерии позволили создать ряд аналогов инсулина, обладающих заданными свойствами абсорбции из подкожного депо, что облегчило контроль уровня инсулина в крови. В пособии описаны и перспективные направления биотехнологии в области эндокринологии, например, замещение инсулин-продуцирующих клеток при сахарном диабете типа 1 за счет стволовых клеток. Источником таких клеток, способных дифференцироваться в инсулин-продуцирующие, может служить как эмбриональная ткань, так и ткани и органы взрослого организма (в особенности поджелудочная железа и жировая ткань). Вопросы дифференцировки стволовых клеток, развития инсулин-продуцирующих клеток из стволовых, выбора наиболее оптимального источника стволовых клеток для тканевой инженерии подробно освещены в пособии. Другим подходом, разрабатываемым в настоящее время является микроинкапсуляция пересаженных от донора островков Лангерганса с целью избегания иммунного отторжения. В пособии также рассматрены подходы к созданию биоинженерного аналога щитовидной железы ex situ с акцентом на топологический подход.
-
область применения (факультет, учебный курс): Лечебный факультет и ФПДО; курсы «Патофизиология» и «Клеточные биотехнологии в современной медицине»
-
характер издания (учебник, учебное пособие и др.): рукопись учебного пособия
-
формируемые компетенции (знания, умения и навыки): Теоретические и практические основы использования клеточных биотехнологий в эндокринологии
-
объем (печатных листов или др.): 80 стр. формата А4.
Часть 1. Биотехнология получения гормонов.
Глава 1. Синтез инсулина. Технология рекомбинантной ДНК.
Если мы спросим, каков наиболее перспективный источник инсулина, спасающего жизни больных диабетом на протяжении последних десятилетий, то ответ будет очевиден – это рекомбинантный, или биосинтетический инсулин, т.е. инсулин, полученный из клеток бактерий или дрожжей путем применения технологии рекомбинантной ДНК. До разработки этой технологии использовался инсулин, получаемый из поджелудочной железы животных – свиней и коров, однако структура его несколько отличалась от структуры человеческого инсулина, что служило причиной осложнений со стороны иммунной системы, не желающей принять чужеродный белок. Впрочем, практически одновременно с разработкой технологии биосинтетического инсулина, появилась технология получения т.н. полусинтетического инсулина, полностью аналогичного человеческому, путем определенных модификаций инсулина свиней. Этот метод основан на использовании свиного инсулина с ферментно-химической заменой аланина в 30 позиции В-цепи на треонин. Основным недостатком данного метода является зависимость от получения необходимого количества инсулина от свиней, что в будущем при возрастающих потребностях в инсулине грозит серьезными сырьевыми трудностями.
Таким образом, технология рекомбинантной ДНК на сегодняшней день является ведущей технологией по получению инсулина: она позволяет синтезировать сколь угодно большие объемы белка и открывает широкие возможности по созданию аналогов инсулина с заданными свойствами.
Первый коммерческий выпуск человеческого инсулина с помощью технологии рекомбинантной ДНК (рДНК) в 1980 г. стал результатом совместной деятельности клиники «Город Надежды» (Дуарте, Калифорния), университета Калифорнии (Сан-Франциско), корпорации Genetesch и Eli Lilly. Синтезировались гены А- и В-цепей инсулина, после чего вводились в ген -галактозидазы и экспрессировались в Echerichia coli. При получении продукта А- и В-цепи инсулина отделяли от бактериальных белков с помощью цианобромида. Из А- и В-цепей после очистки в дальнейшем синтезировался человеческий инсулин.
В 1986 году тактика производства рекомбинантного инсулина несколько изменилась: инсулин стали получать путем процесса ферментивного преобразования биосинтетического человеческого проинсулина. Ген, кодирующий человеческий проинсулин внедряется в специальные непатогенные штаммы К12 кишечной палочки, которые затем выращивают в процессе ферментации для получения человеческого инсулина. Этап ферментации останавливают путем термической стерилизации, чтобы устранить любую возможность контаминации бактериальными организмами. Таким образом, при биосинтетическом производстве инсулина геном инсулина человека встраивают в геном микроорганизмов – бактерий или дрожжей, которые начинают синтезировать предшественники инсулина, из которых потом ферментативным способом получают инсулин.
Современные технологии двух крупнейших производителей человеческого инсулина - Eli Lilly и Novo Nordisk - отличаются по патентно-правовым причинам. Eli Lilly – первый производитель человеческого инсулина, использовавший генно-инженерную технологию, работает на геноме человека, с помощью которого кишечные палочки синтезируют проинсулин, превращающийся в инсулин после ферментативного отщепления С-пептида. Novo Nordisk применяет синтетически полученную ДНК для «мини-проинсулина» (проинсулина, в котором С-пептид короче, чем в проинсулине человека), которая затем вводится в геном клетки пекарских дрожжей. В дальнейшем из мини-проинсулина ферментативным способом выделяют инсулин.
Структура биосинтетического человеческого инсулина полностью аналогична таковой «натуральной» молекулы, что позволяет снизить количество осложнений, связанных с образованием антител. Основной сложностью, возникающей при синтезе рекомбинантного инсулина, является загрязнение продукта собственными белками бактерий, а также наличие иных примесей (например, примеси проинсулина). Эта проблема была полностью решена введением сложного процесса очистки получаемого белка путем многоступенчатой гельфильтрационной и ионообменной хроматографии, в результате которых в современном биосинтетическом инсулине примеси не определяются даже высокочувствительными методами.
Синтез инсулина бактериальными клетками.
Итак, в чем суть технологии биосинтеза инсулина [1] при использовании бактериальных клеток? «Фабрикой» по производству инсулина является всем известная кишечная палочка, обитатель пищеварительного тракта человека. Бактерия E.coli является, пожалуй, наиболее изученной бактериальной клеткой, а также клеткой-мишенью наиболее изученных бактериофагов. Сама по себе кишечная палочка не способна поглощать экзогенную ДНК, поэтому необходимо создать условия для проникновения чужеродной ДНК внутрь клетки, а также ее последующей репликации. Клетка E.coli окружена муреиновым мешком, прилегающим к внешней мембране: путем обработки клеток лизоцимом получают сферопласты. Для этого сначала применяют комплексообразователь этилендиаминтетрауксусную кислоту (EDTA), связывающую двухвалентные катионы, которые стабилизируют липополисахаридный слой внешней мембраны грамотрицательных бактерий. После этого лизоцим уже может достигнуть муреинового мешка и гидролизовать его, что значительно повышает проницаемость бактериальной клетки и позволяет ввести в нее векторную ДНК.
Однако прежде чем вводить необходимый ген в клетку, его необходимо получить и ввести в состав вектора. Для этого существуют различные подходы: например, выделение искомого гена из нативной молекулы ДНК или синтез копии гена по матрице выделенной мРНК, однако, поскольку нуклеотидная последовательность ДНК, кодирующей проинсулин, а также А- и В-цепи инсулина известна, наиболее удобным является метод химического синтеза ДНК. Для синтеза А-цепи инсулина необходимо 63 нуклеотида и 90 нуклеотидов для В-цепи, плюс кодон на конце каждой цепи, сигнализирующий об окончании синтеза белка (стоп-кодон). Кроме того, к началу каждого фрагмента ДНК, кодирующего А- или В-цепь, добавляют анти-кодон, кодирующий метионин, чтобы в последующем можно было отделить молекулу инсулина от фрагмента бактериального белка. Далее синтезированные гены А- и В-цепей инсулина (либо ген проинсулина) вставляют в ген бактериального фермента - -галактозидазы (lacZ), и затем всю эту конструкцию помещают в векторную плазмиду [1]. Что представляет собой вектор? Это носитель, задачей которого является доставить нужную ДНК в клетку-носитель и обеспечить ее экспрессию. Часто в качестве вектора используют плазмиды – кольцевидные самореплицирующиеся нехромосомные формы организации ДНК, присутствующая в большинстве бактерий (см. рис.1). Помимо гена, кодирующего нужный белок (например, ту или иную цепь инсулина, либо проинсулин), вектор должен нести в своем составе регуляторные элементы, необходимые для экспрессии данного гена (в нашем случае транскрипцию гена инсулина будет обеспечивать промотор гена -галактозидазы, упомянутой выше), а также маркерный ген, позволяющий отличить трансформированные клетки от нетрансформированных (часто это ген устойчивости к какому-либо антибиотику, например, ампициллину).
Рис.1. Электронная фотография бактериальной плазмиды.
Каким образом можно вставить нужный ген в плазмиду? В этом помогают специальные ферменты, «разрезающие» молекулу ДНК в участках, соответствующих определенным последовательностям нуклеотидов длиной 4-8 нуклеотидных пар (это т.н. сайты рестрикции). Ферменты эти были открыты в 1968 году и названы рестриктазами. В природе рестриктазы являются элементом бактериальной защиты от фагов: в каждом сайте рестрикции собственной ДНК бактерии остатки аденина и цитозина подвергаются метилированию, что препятствует работе рестриктазы, в то время как, если в клетку попадает чужеродная ДНК (например, бактериофага), рестриктаза режет ее на кусочки. В генной инженерии рестриктазы используются в качестве «молекулярных ножниц», разрезающих плазмиду (в том месте, куда необходимо вставить ген), а также для выделения нужного гена из более протяженного участка ДНК. После разрезания рестриктазой на концах получившихся фрагментов ДНК образуются т.н. «липкие» концы, которые при смешивании плазмид и генов формируют временные связи, а затем ген окончательно «пришивается» к плазмиде ферментом ДНК-лигазой (см. рис.2).
Рис.2. Пример «работы» рестриктазы. В данном случае сайтом рестрикции является последовательность aaactc и tttgag.
Итак, все необходимые гены находятся в составе плазмиды и плазмида введена в бактерию. Что происходит дальше? Необходимо произвести селекцию, т.е. отобрать те бактерии, в которых находится и экспрессируется ген инсулина. Для этого бактерии выращивают последовательно в двух средах: одна из них содержит ампициллин, другая – вещество, реагирующее с продуктом гена lacZ. При выращивании в ампициллин-содержащей среде, бактерии, не получившие векторные плазмиды вместе с геном устойчивости к ампициллину гибнут, те же кишечные палочки, которые захватили плазмиды, остаются в живых и размножаются. Помимо этого, необходимо выделить те бактерии, внутри которых находятся именно рекомбинантные плазмиды (ведь плазмида при инкубации с геном может и не включить его в свой состав). Мы должны вспомнить, что ген инсулина вставляли внутрь гена lacZ, кодирующего фермент -галактозидазу. Бактерии с интактным lacZ геном окрашиваются в специальной среде в синий цвет. Очевидно, что в бактериях, несущих рекомбинантные плазмиды, -галактозидаза не экспрессируется, и такие бактерии в синий цвет окрашиваться не будут. В дальнейшем, когда не окрашенные и выжившие в ампициллиновой среде бактерии размножаются, нам остается только удостовериться в том, что они экспрессируют ген проинсулина (или одной из его цепей). Для этого существует ряд способов. Во-первых, можно определить содержание продукта в бактериальной среде. Во-вторых, можно провести кДНК-гибридизацию: синтезировать фрагмент ДНК, комплементарный гену проинсулина (или его участку), присоединив к нему радиоактивный или флуоресцентный зонд. В дальнейшем бактериальную ДНК денатурируют и инкубируют с содержащим зонд фрагментом. Если искомый ген есть в геноме бактерии, он связывается с зондом и «выдает» себя по свечению или радиоактивному излучению.
Таким образом, получают кишечные палочки, содержащие ген, кодирующий одну из цепей инсулина, либо проинсулин. Бактерии размножаются, ген реплицируется и экспрессируется. (рис.3).
Рис.3. Получение бактерий, содержащих ген, кодирующий цепь инсулина
Синтезируемый такими бактериями белок представляет собой фрагмент -галактозидазы, соединенный с А- или В-цепью инсулина (или с проинсулином). Цепочки инсулина отщепляют от -галактозидазы и очищают. Затем их смешивают и путем реакции образования дисульфидных связей получают биосинтетический инсулин (Humulin). В случае же получения проинсулина добавляется еще этап ферментативного отщепления С-пептида.
Получение инсулина из клеток дрожжей. Лидерные последовательности.
Альтернативой инсулину, получаемому из бактерий, является рекомбинантый инсулин, получаемый из клеток дрожжей Saccharomyces cerevisiae. Эти прокариотические организмы способны синтезировать не отдельные цепи, а цельную молекулу инсулина (или его предшественника), что минимизирует необходимость в сложных и дорогостоящих процедурах очистки продукта. S. сerevisiae обладают сложной многокомпонентной секреторной системой, позволяющей осуществлять посттрансляционные модификации гетерологичных белков, в т.ч. N- и О-гликозилирование, а также формирование дисульфидных связей. Эти модификации аналогичны таковым, происходящим в клетках млекопитающих, что позволяет синтезировать с помощью дрожжей биологически активные белки млекопитающих, в т.ч. инсулин.
Вспомним, как происходит биосинтез инсулина в клетках островков Лангерганса. Сначала синтезируется препроинсулин, имеющий структуру препептид-В-Arg-Arg-C-Lys-Arg-A, где А и В – это А- и В-цепи проинсулина соответственно, а С – это С-пептид. Препептид отщепляется при транспортировке молекулы в эндоплазматический ретикулум (ЭПР). К тому времени, как проинсулин достигает аппарата Гольджи, уже успевают сформироваться дисульфидные связи, придающие ему определенную структуру в пространстве. Затем проинсулин расщепляется в двух точках, так что отщепляется С-пептид и образуется инсулин.
В клетках дрожжей подобная система осуществляет посттрансляционные модификации -фактора. Что такое - -фактор? Это собственный белок дрожжей, принимающий самое непосредственное участие в их половом размножении. Дело в том, что существенным элементом жизненного цикла этих эукариотических организмов является стадия коньюгации. На этой стадии гаплоидные клетки (т.е. клетки несущие по одной копии каждой хромосомы) сливаются, образуя диплоидную клетку. Для того чтобы прошел процесс коньюгации (коньюгация может происходить между клетками разных половых типов; принадлежность к половому типу определяется геном MAT, имеющем два аллельных состояния a и ) необходимо чтобы сливающиеся клетки были остановлены в точке G1-S перехода. Остановка достигается с помощью вышеупомянутого -фактора, выделяемого в среду клетками полового типа . -фактор рецептируется клетками типа а, которые в ответ останавливаются в точке G1-S перехода. Так вот, возвратимся к биосинтезу -фактора в клетках дрожжей: первоначально синтезируется его предшественник - препептид-Lys-Arg-(Glu-Ala)2-F-Lys-Arg-(Glu-Ala)3-F-(Lys-Arg-
Glu-Ala-Asp-Ala-Glu-Ala-F)2. Далее он подвергается процессингу, в ходе которого происходит трипсиноподобное расщепление в точках последовательностей Lys-Arg, а потом дипептидиламинотрансферраза вырезает последовательности Glu-Ala и Asp-Ala [Thim L et al. 1986].
Особенностью биосинтеза инсулина в клетках дрожжей является необходимость добавления к гену, кодирующему инсулин, лидерной последовательности, благодаря которой и становится возможным осуществление посттрансляционных модификаций «объединенного» белка. С этой целью наиболее часто используется препролидерная последовательность вышеупомянутого -фактора (см. рис. 4).
Рис.4. Структура «объединенного» белка, состоящего из препептида, пропептида, сайта распознавания Kex2, пептидного спейсера и предшественника инсулина. Звездочками отмечены точки N-гликозилирования.
Присоединенная к гену гетерологичного белка препролидерная последовательность -фактора опосредует в дальнейшем транслокацию предшественника инсулина в ЭПР, а оттуда – в аппарат Гольджи. При этом в ЭПР происходит отщепление сигнальной пептидазой пре-региона лидерной последовательности, а в аппарате Гольджи эндопротеаза Kex2 отщепляет ее про-регион. Kex2 «работает» на определенном участке, состоящем из двух аминокислот – Lys-Arg. Далее, уже перед самой секрецией, дипептидиламинотрансфераза, кодируемая геном STE13, отщепляет от белка оставшийся пептидный спейсер, после чего гетерологичный белок (в нашем случае – предшественник инсулина) высвобождается в межклеточное пространство (см. рис. 5) [Ostergaard S et al.2000].
Рис.5. Секреция гетерологичного белка (инсулина) клетками дрожжей, в ходе которой происходит отщепление препептида сигнальной пептидазой, пропептида – Kex2-эндопротеазой и пептидного спейсера – дипептидиламинотрансферразой (Ste13).
Первоначально применялась полная препролидерная последовательность -фактора со спейсером, имеющим структуру Glu-Ala-Glu-Ala. Однако такой спейсер плохо удалялся дипептидиламинопептидазой, в результате чего получаемый продукт содержал большую долю примеси Glu-Ala-Glu-Ala-предшественника инсулина. В одном из исследований оказалось, что, если направленным мутагенезом удалить спейсер из структуры лидерной последовательности, вышеупомянутой проблемы можно избежать. Некоторые исследователи, напротив, полагали, что присутствие спейсера необходимо, так как способствует более эффективному процессингу Kex2. Недостаточная «работа» этого фермента приводит к гипергликозилированию белка, что значительно снижает выход инсулина. В конце концов, были созданы спейсеры, более протяженные по длине, эффективно удаляемые трипсином и лизин-специфичной протеазой I, и это позволило в два раза повысить выход предшественника инсулина.
Другой подход к повышению эффективности синтеза инсулина в клетках дрожжей – создание синтетических лидерных последовательностей. Такие «лидеры» могут увеличить выход предшественника инсулина с «правильной» трехмерной структурой, так, что он превысит выход, наблюдаемый при использовании препролидера -фактора. Этот эффект коррелирует с увеличением времени нахождения белка в эндоплазматическом ретикулуме, что, видимо, способствует формированию правильной пространственной конформации инсулина (т.е. белок получает дополнительное время на то, чтобы успеть нужным образом «свернуться»). Кроме того, выход продукта повышает исключение сайтов N-гликозилирования из синтетических лидерных последовательностей (чего не наблюдается в случае использования -факторного препролидера). Также можно синтезировать лидерные последовательности, лишенные сайта распознавания Kex2 – в этом случае дрожжи будут секретировать предшественник инсулина, соединенный с пролидерной последовательностью, отщепление которой осуществляется in vitro. Преимущество этого подхода состоит в том, что синтетический пролидер может увеличить стабильность и растворимость «объединенного» белка, создав наиболее благоприятные условия для его последующей очистки и «созревания».
Аналоги инсулина
Аналогами инсулина называют белки, полученные путем модификации структуры молекулы нормального человеческого инсулина. Такой, модифицированный путем генной инженерии, инсулин обладает несколько иными – более предпочтительными в клинической практике - биологическими и фармакодинамическими свойствами. Первый аналог - инсулин лизпро - был введен во врачебную практику в 1996 году. Через 4 года эндокринологи смогли взять на вооружение два других рекомбинантных аналога - инсулин гларгин и инсулин аспарт.
Прежде всего, зададим вопрос: для чего понадобились рекомбинантные аналоги инсулина? Вспомним, что у здорового человека после приема пищи концентрация инсулина в крови быстро повышается, достигая максимума через 30-45 мин и возвращаясь к базальному уровню через 2-3 часа. Фармакокинетические характеристики препаратов человеческого инсулина таковы, что практически невозможно достигнуть устойчивой нормогликемии. При подкожной инъекции короткодействующий препарат человеческого инсулина «правильной» структуры слишком медленно начинает действовать и действие его длится дольше по сравнению с тем, как это происходит у здорового человека (так происходит из-за того, что молекулы инсулина начинают формировать димеры и гексамеры, что мешает им быстро абсорбироваться из места инъекции). В результате этого может наблюдаться ранняя постпрандиальная гипергликемия и повышается риск гипогликемии перед следующим приемом пищи. В случае же использования препаратов человеческого инсулина средней продолжительности или длительного действия, как правило, не удается достичь идеально стабильного базального уровня инсулина в крови. При их применении достигается нежелательный пик концентрации через 3-4 часа после инъекции, а, кроме того, биодоступность таких препаратов значительно варьирует у разных людей и даже у одного и того же человека. Таким образом, возникла необходимость в создании аналогов инсулина с измененными свойствами: с более быстрым началом и меньшей продолжительностью действия для препаратов короткого действия и более плоской кривой «время-эффект» и менее «изменчивой» биодоступностью для препаратов продленного действия.
Аналоги инсулина короткого действия.
Итак, путем внесения небольших изменений в аминокислотную последовательность молекулы инсулина (см. рис.6) удалось добиться снижения «стремления» молекул агрегировать и образовывать димеры и гексамеры, за счет чего повысилась скорость их абсорбции, что означает более быстрый эффект и меньшую продолжительность действия.
Рис.6. Структура человеческого инсулина
Инсулин Asp (B10). Это один из первых аналогов инсулина, предложенный к клиническому применению. В его молекуле аминокислота гистидин в 10 позиции В-цепи заменена на аспарагин, а отличительной особенностью является быстрая абсорбция (в 2 раза быстрее обычного инсулина). В ходе исследований этого аналога выяснилось, что замена единственной аминокислоты привела к изменению трехмерной структуры белка, что отразилось на его взаимодействии со своим рецептором, а именно: повысилась афинность к рецептору инсулина и ИФР-1 и снизилась скорость диссоциации. Таким образом, метаболический инсулина Asp превышал таковой обычного инсулина. И все бы хорошо, если бы не повышенная митогенная активность этого аналога, выявленная на некоторых клеточных линиях, а когда оказалось, что инсулин Asp повышает частоту аденокарциномы у животных, его дальнейшие испытания и вовсе прекратили.
Инсулин лизпро (Eli Lilly & Co., Indianapolis, IN). Участок В26-30 молекулы инсулина не играет роли в связывании с рецептором, однако важен для образования инсулиновых димеров. Это значит, что любые изменения в этом участке не повлияют на связывание с рецептором, но могут снизить тенценцию молекул гормона к димеризации, что повысит скорость абсорбции.
Инсулин лизпро оказался первым генноинженерным аналогом инсулина, введенным в клиническую практику. Он был получен путем реверсии пролина в 28 позиции и лизина в 29 позиции В-цепи, что заметно снизило способность молекул к ассоциации друг с другом, не повлияв на аффинность к рецептору инсулина. И хотя, аффинность к рецепотору ИФР-1 несколько повысилась, это не привело к повышению митогенной активности аналога по сравнению с нормальным инсулином. Было также показано, что иммуногенность инсулина лизпро не отличается от обычного инсулина. Более того, некоторые пациенты с резистентностью к нормальному человеческому инсулину вследствие формирования антител могли, тем не менее, успешно применять инсулин лизпро.
Инсулин аспарт [NovoLog (Novo Nordisk, Princeton, NJ)]. Другим примером изменения аминокислотной последовательности инсулиновой молекулы с целью создания короткодействующего аналога инсулина является инсулин аспарт (Asp B28), в котором замена пролина в 28 позиции В-цепи на аспарагиновую кислоту привела к снижению способности молекул к димеризации. Этот аналог инсулина был одобрен к клиническому применению в июне 2000 года в США. Кинетика взаимодействия инсулина аспарт с рецепторами к инсулину и ИФР-1 полностью аналогична таковой нормального инсулина, однако его аффинность к рецептору ИФР-1 несколько снижена. Инсулин аспарт абсорбируется в два раза быстрее обычного инсулина и достигает в два раза большей максимальная концентрации в крови, в то время как продолжительность его действия меньше. Таким образом, даже при введении этого аналога непосредственно до еды, постпрандиальный уровень глюкозы будет меньше, чем при введении обычного инсулина за 30 мин до еды. Кроме того, снижается риск поздней постпрандиальной гипогликемии.
Аналоги инсулина длительного действия.
В настоящее время интенсивно изучается проблема преобразований молекулярной структуры инсулина с тем, чтобы замедлить и стабилизировать кинетику абсорбции с целью создания препаратов длительного действия. Один из способов пролонгировать действие инсулина – поднять его изоэлектрическую точку с рН 5,4 до нейтральных значений, путем разработки аналогов с большим числом положительно заряженных аминокислот в молекуле. Тогда молекулы становятся менее растворимыми в нейтральной среде, и подкожная инъекция такого аналога приведет к кристаллизации молекул в месте инъекции, что замедлит их абсорбцию в системный кровоток.
NovoSol Basal (Novo Nordisk). NovoSol Basal (B27Arg, A21Gly, B30Thr-NH2) - первый аналог инсулина длительного действия, созданный с помощью технологии рекомбинантной ДНК. Оказалось, что его период полувыведения превышает таковой инсулина Ультратард НМ (Novo Nordisk) – одного из наиболее длительно действующих препаратов, однако из-за низкой биодоступности для достижения адекватного контроля уровня глюкозы в крови требовались в два раза большие дозировки этого аналога. Кроме того, несмотря на небольшой уровень интраиндивидуальной вариабельности его эффекта, уровень интериндивидуальной вариабельности (т.е. вариабельности между различными индивиуумами) оставался высоким. Вследствие этих причин, дальнейшие испытания NovoSol Basal были прекращены.
Инсулин гларгин [HOE 901, LANTUS (Aventis Pharmaceuticals, Parsippany, NJ)]. Этот биосинтетический аналог инсулина длительного действия был введен в клиническую практику в апреле 2000 года в США и в июне того же года в Европе. Инсулин гларгин был получен путем элонгации С-конца В-цепи молекулы инсулина посредством добавления двух остатков аргинина, а также замены аспарагина в 21 позиции А-цепи на глицин (A21Gly, B31Arg, B32Arg). Эти модификации привели к сдвигу изоэлектрической точки с рН5,4 к рН6,7, что сделало это аналог менее растворимым при физиологических значениях рН. Кроме того, замена аспарагина на глицин увеличила его биодоступность, благодаря чему, в отличие от NovoSol Basal, инсулин гларгин был одобрен для клинического применения. После инъекции эффект инсулина гларгин длится в течение 24 часов без выраженного пика концентрации в крови, и действует он «мягче» и с меньшей вариабельностью, чем НПХ-инсулины (НПХ это аббревиатура названия белкового пролонгатора - "Нейтральный Протамин Хагедорна"). Другое преимущество этого аналога в том, что если для НПХ-инсулинов эффект зависит от места введения, для инсулина гларгин такой зависимости выявлено не было.
Ацилированные инсулины. Другой способ пролонгировать эффект инсулина – «заставить» его связываться с белками плазмы. Как известно, некоторые гормоны обладают способностью связываться с белками-переносчиками в плазме, что продлевает их период полувыведения. Достигнуть этого можно путем соединения молекулы инсулина с неэстерифицированной жирной кислотой (т.е. ацилированием), которая, в свою очередь, может связываться с альбумином. Поскольку альбумин всегда присутствует в подкожной тканевой жидкости, связывание инсулина с этим белком значительно замедлит скорость его абсорбции и пролонгирует действие. Ацилирование молекулы инсулина обычно производят по остатку лизина в 29 позиции В-цепи. Такой аналог – инсулин детемир (Levemir), в частности, был разработан фирмой Novo Nordisk. Инсулин детемир (LysB29-tetadecanoyl, des(B30)-insulin) был одобрен к применению в Европе с июля 2004 года, а в США в 2006 году. Время абсорбции этого аналога из места введения превышает таковое у НПХ-инсулинов, а интеридивидуальная вариабельность эффектов ниже. Также по сравнению с НПХ-инсулинами нет выраженного пика концентрации в крови, характерно более медленное начало действия. Инсулин детемир имеет меньшую аффинность связывания с рецептором инсулина (и проявляет меньший эффект по сравнению с обычным инсулином при введении в эквимолярной дозе), но диссоциирует дольше. Было показано также, что связывание этого аналога инсулина с альбумином происходит независимо от связывания с альбумином других лекарственных препаратов, что значительно снижает вероятность лекарственных взаимодействий.
РЕЗЮМЕ ГЛАВЫ
Синтез инсулина бактериальными клетками
Получение инсулина из клеток дрожжей.
Модификация нормального человеческого инсулина
Синтез инсулина бактериальными клетками
Получение гормона
Помещение гена гормона в вектор
Введение вектора в бактерию
Селекция бактерий, содержащих рекомбинантные гены
Синтез инсулина клетками дрожжей S. сerevisiae
Добавление лидерной последовательности к гену инсулина
Отщепление пре-региона в ЭПР дрожжей
Отщепление про-региона в аппарате Гольджи дрожжей
Отщепление спейсера
Секреция рекомбинантного гормона дрожжами
Модификация человеческого инсулина
Аналоги инсулина
Аналоги инсулина короткого действия
Инсулин лизпро
Инсулин аспарт
Аналоги инсулина длинного действия
Инсулин гларгин
Инсулин детемир
|