Инструкция по применению «вич-1,2 аг/ат комботест»

ИНСТРУКЦИЯ ПО ПРИМЕНЕНИЮ

плазме крови человека методом иммуноферментного анализа.

Принцип метода

Для проведения анализа используется полистироловый 96-луночный планшет, на поверхности лунок которого сорбированы синтетический пептид, представляющий собой иммунореактивную детерминанту субтипов ВИЧ-1 группы 0, рекомбинантный протеин, представляющий собой иммунореактивные детерминанты белков оболочки вирусов ВИЧ-1 и ВИЧ-2, а также pol белка ВИЧ, и моноклональные антитела к белку р24. Конъюгат представляет собой смесь антигенов ВИЧ, упомянутых выше, и моноклональных антител к белку р24, конъюгированных с пероксидазой хрена. Тестируемый образец сыворотки крови инкубируется в лунке планшета-иммуносорбента, антиген р24 и/или антитела к ВИЧ-1,2 присутствующие в образце, связываются с соответствующими антителами или антигенами ВИЧ, которыми покрыта поверхность лунки. Затем, после стадии промывания лунок, вносится конъюгат, который связывается с соответствующими антителами и/или антигеном р24 ВИЧ-1, уже связавшимися с соответствующими агентами на поверхности лунки. Не связавшиеся реагенты затем удаляют повторным промыванием, и в лунку вносится рабочий раствор хромогена, содержащий 3,3’,5,5’-тетраметилбензидин (ТМБ) и перекись водорода. Цвет раствора в лунках, содержащих

связавшийся конъюгат, в ходе инкубации становится голубовато-зеленым, после добавления стоп-реагента превращается в желтый. По завершении реакции оптическая плотность раствора (ОП) определяется на спектрофотометре при длине волны 450 нм/620 нм.

Состав набора

Меры предосторожности при работе с набором

• Перед началом проведения анализа выдержать набор реагентов при температуре от 18 до 30 ˚С в течение 30 минут. Сразу после использования остатки реагентов следует поместить в места их хранения (температура хранения от 2 до 8˚С).

• Лабораторная стеклянная посуда, предназначенная для приготовления рабочих растворов реагентов, должна быть предварительно тщательно вымыта с использованием 1,0 М соляной кислоты и затем промыта очищенной водой. Следует отдавать предпочтение одноразовой пластиковой посуде.

• Во время хранения или проведения анализа не подвергать реагенты воздействию прямого солнечного света.

• Во время проведения анализа не допускать подсыхания стенок лунок.

• Предусмотреть меры по предотвращению перекрестной контаминации реагентов. Важно, например, использовать одну маркированную пипетку только для работы с рабочим раствором хромогена, а другую - только для работы с конъюгатом.

• Избегать забрызгивания краев лунок раствором конъюгата. Избегайте дотрагиваться до краев лунок кончиком пипетки с конъюгатом. Не выдувайте воздух из кончика пипетки одновременно с внесением очередного реагента в лунку. Для наиболее полного удаления реагента из кончика пипетки используется метод пипетирования.

• Перед измерением оптической плотности жидкости в лунках убедиться, что внешние поверхности лунок планшета чистые и сухие, а на внутренних поверхностях лунок нет пузырей воздуха.

• Избегать контаминации лунок тальком от одноразовых перчаток.

• Не использовать СО₂ инкубаторы для инкубации планшетов во время проведения анализа.

• Температура инкубации должна быть от 36 до 38 ˚С.
Оборудование и материалы, необходимые для проведения анализа

1. Вода очищенная;

2. рН-метр;

3. Спектрофотометр;

4. Вошер;

5. Термостат;

6. Ламинарный шкаф;

7. Таймер;

8. Холодильник;

9. Дозаторы одноканальные или с фиксированным объемом со сменными наконечниками, позволяющие отбирать объемы жидкости 1-200 мкл, 100-1000 мкл, 1000- 5000 мкл;

10. Мерные цилиндры на 10 мл, 25 мл, 50 мл, 100 мл, 500 мл;

11. Вакуумный аспиратор, содержащий 5% гипохлорид натрия;

12. Перчатки резиновые.
Приготовление рабочих растворов реагентов

• 
  Рабочий раствор конъюгата
  

Рабочий раствор конъюгата хранить при температуре от 2 до 8 ˚С в течение 4 недель.

• 
  Рабочий раствор хромогена
  

Важно, чтобы процедура приготовления проводилась в указанном порядке и чтобы все используемые пипетки и лабораторное стекло были чистыми. Рабочий раствор хромогена может быть приготовлен следующим образом: путем простого добавления содержимого одного флакона раствора для разведения хромогена во флакон, содержащий концентрат хромогена. Содержимого одного флакона, приготовленного таким образом рабочего раствора хромогена достаточно, как минимум, для 5 планшетов (см. Таблицу). Рабочий раствор хромогена готовится непосредственно перед добавлением в лунки планшета и не хранится.

• 
  Отмывающий раствор (концентрат х20)
  

Рабочий раствор буфера для промывки следует хранить при температуре от 15 до

30 ˚С в плотно закрытом сосуде в течение 1 мес.
Анализируемые образцы

Для анализа необходимо использовать неразведенную сыворотку или плазму крови человека. Для получения сывороток из вены берут кровь в пробирку для центрифугирования и выдерживают при температуре от 18 до 30 ˚С не менее 3 ч, либо при температуре от 36 до 38 ˚С – 1 ч. Далее центрифугируют 30 мин при 1200 об/мин. Для получения плазмы крови используют консервант ЭДТА или цитрат натрия.

Образцы исследуемых сывороток могут выдерживать нагревание до 56 ˚С

в течение 3 ч.

Образцы, отобранные для анализа, должны храниться при температуре от 2 до 8 ˚С не более 72 ч.

Образцы сывороток или плазмы, не использованные для анализа в течение 72 ч, заморозить и хранить при температуре от минус 15 до минус 25 ˚С. Необходимо избегать замораживания и оттаивания образцов более трех раз.

-Выдержать набор реагентов при температуре от 18 до 30 ˚С в течение 30 мин.

-Рассчитать необходимое количество стрипов для анализа с учетом контролей

(К^-, К₁⁺, К₂⁺, К_АГ⁺).

-Внести по 25 мкл раствора для разведения образцов в каждую лунку.

-Внести по 100 мкл исследуемых сывороток и контрольных образцов в лунки планшета (К^-, К₁⁺, К₂⁺, К_АГ⁺). Для каждого полного планшета используйте лунки первой колонки для внесения контрольных образцов.

-Внести контроли в указанные лунки после того, как все образцы уже внесены, а именно: внести по 100 мкл отрицательного контрольного образца (К^-) в лунки А1, В1 и С1; по 100 мкл положительных контрольных образцов (К₁⁺, К₂⁺, К_АГ⁺) в лунки D1, Е1, F1 соответственно.

-Использовать поверхность белого цвета для визуализации факта внесения всех образцов в лунки.

-Закрыть планшет крышкой и поместить его в термостат на 60 мин при температуре от 36 до 38 ˚С.

-По окончании инкубации промыть лунки планшета рабочим промывочным раствором 5 раз, при этом убедитесь, что:

• 
  разливаемый в лунки объем составляет 500 мкл, при использовании вошера убедитесь, что лунки заполняются полностью;
  
• 
  высота игл вошера для розлива должна быть установлена таким образом, чтобы отмывающая жидкость полностью заполняла лунки и не переливалась через их край;
  
• 
  время одного цикла отмывки планшета, включающего наполнение лунок/отмывку/аспирация/замачивание, составляет примерно 30 сек;
  
• 
  при окончательной аспирации лунок в них не должна оставаться жидкость; используйте, где это технически возможно, процедуру двойной аспирации или осушайте лунки, осторожно постукивая планшетом по фильтровальной бумаге.
  

-Закрыть планшет крышкой и поместить его в термостат на 30 мин при температуре от 36 до 38 ˚С.

-По окончании инкубации пятикратно отмыть лунки планшета тем же раствором и по той же схеме как указано выше.

-Сразу после отмывки лунок планшета внести в каждую из них по 100 мкл рабочего раствора хромогена.

-Закрыть планшет крышкой и поместить его в термостат на 30 мин при температуре от 36 до 38 ˚С.

-Избегать попадания прямого солнечного света на планшет. В лунках, содержащих положительные образцы, развивается голубовато-зеленое окрашивание.

-Внести в каждую из лунок по 50 мкл стоп-реагента.

-Сразу, но не позднее 15 мин, измерить на спектрофотометре оптическую плотность раствора в лунках планшета при длине волны 450 нм и референс-фильтре с длиной волны от 620 до 690 нм. Предварительно бланкировать фотометр по воздуху.

Регистрация и интерпретация результатов

-Результаты, полученные на каждом планшете, должны учитываться отдельно, независимо от того, сколько планшетов взято в постановку анализов.

-Вычислить среднее значение оптической плотности отрицательного контроля (К^-).

Пример:

Лунка В1 0.086 о.е.

Лунка С1 0.070 о.е.

Среднее значение 0.240/3 = 0.080 о.е.

Среднее значение ОП отрицательного контроля - 0.080 о.е.

Критический уровень (ОП_крит) = 0.080+0.150=0.230 о.е.

-Рекомендуется классифицировать образцы со значением ОП _450/620 > ОП _(К-₎ + 0.07 о.е., но (К-₎ + 0.15 о.е., как погранично положительные (серая зона). Погранично положительные образцы должны быть перетестированы в повторах. Если погранично реактивный результат повторяется, или если получены противоречивые результаты, необходимо тестировать образцы с использованием тест-системы другого производителя или в подтверждающем тесте:

• 
  если получен положительный результат при использовании тест-систем другого производителя или в подтверждающем тесте, то считается, что сыворотка содержит антитела к ВИЧ- антигенам;
  
• 
  если значение ОП₄₅₀ образца остается в серой зоне, или если получены противоречивые результаты, то донор или больной, чья кровь исследовалась, в дальнейшем нуждается в наблюдении врача.
  

-Результаты анализа можно учитывать, если соблюдены следующие критерии:

• 
  среднее значение оптической плотности отрицательного контроля должно быть меньше, чем 0.15 о.е;
  
• 
  значение оптической плотности любого из положительных контролей должно быть на 0.8 о.е. больше, чем среднее значение ОП отрицательного контроля.
  

-Образцы, оптическая плотность которых оказалось меньше критического уровня в постановке, рассматриваются как отрицательные.

-Образцы, оптическая плотность которых оказалась равной или выше значения критического уровня в постановке, рассматриваются как положительные.

-Рекомендуется классифицировать образцы со значением ОП_450/620 > ОП_(К-₎ + 0.07 о.е., но (К-₎ + 0.15 о.е., как погранично положительные (серая зона).

1) При контроле на стандартной панели сывороток, содержащих антитела к ВИЧ 1 типа (ОСО 42-28-212-02П) все образцы должны иметь ОП > ОП_(крит). Чувствительность – 100%.

2) При контроле на стандартной панели сывороток, содержащих антитела к ВИЧ 2 типа

(ОСО 42-28-216-02) образцы должны иметь ОП > ОП_(крит). Чувствительность – 100%.

3) При контроле на стандартной панели сывороток, содержащих антиген р24 ВИЧ 1 типа

(ОСО 42-28-375-05) – значение ОП сыворотки, содержащей антиген в концентрации 25 пг/мл должно быть ≥ ОП_(крит).

Минимальная чувствительность набора реагентов при выявлении антигена р24 ВИЧ 1 должна быть 25 пг/мл.
2. Специфичность

При контроле на стандартной панели, не содержащей антитела к ВИЧ

(ОСО-42-28-214-02) ОП всех образцов должна быть (крит).

Специфичность – 100%.

Транспортирование наборов должно проводиться в соответствии с СП 3.3.2.1248-03, при температуре от 2 до 8 ^оС. Допускается транспортирование при температуре от 9 до 25 ^оС в течение 3 суток. Замораживание не допускается.

Хранение наборов в упаковке предприятия-изготовителя должно производиться в соответствии с СП 3.3.2.1248-03, при температуре от 2 до 8 ^оС в течение всего срока годности. Замораживание не допускается.
Срок годности

Срок годности - 12 мес. Набор с истекшим сроком годности применению не подлежит.

Условия отпуска - для лечебно-профилактических и санитарно-профилактических учреждений.
Рекламации на качество Набора направлять в адрес предприятия – изготовителя: ООО «НИАРМЕДИК ПЛЮС» Россия , 125047, г. Москва, ул. 4-я Тверская-Ямская; д.2/11, стр.2, тел./факс (495) 741-49-89 и в адрес Национального органа контроля МИБП, ФГУН ГИСК им. Л.А. Тарасевича Роспотребнадзора, Россия, 119002, г. Москва, пер.Сивцев Вражек, д. 41, (495) 241-39-22.
===========================================================

К. 7-14-3.04 В. 020609