Учебно-методический комплекс дисциплины «Молекулярная биология» по кредитной технологии обучения для студентов специальности

Литература:

1. Молекулярная биология. Учебное пособие для студентов медицинских вузов Автор: Мушкамбаров Н.Н., Кузнецов С.Л. Изд-во: Медицинское информационное агентство, 2007. С. 536

2. 
   Молекулярная биология: Структура и биосинтез нуклеиновых кислот/ Под ред. А.С.Спирина. М.: Академия, 2011.
   
3. 
   Бокуть С.В., Герасимович Н.В., Милютин А.А. Название: Молекулярная биология, изд-во:Вышэйшая школа, Год: 2005
   

1. 
   Макромолекулярная структура РНК Транспортные РНК
   
2. 
   Рибосомные РНК
   
3. 
   Матричные РНК
   
4. 
   Гетерогенная ядерная РНК
   
5. 
   Малые ядерные РНК
   
6. 
   Малые цитоплазматические РНК
   
7. 
   U-PHK млекопитающих
   

Цель: ознакомить с процессом созревания РНК

Содержание лекции:

В отличие от эукариотических, большинство бактериальных иРНК представляют собой первичные транскрипты, которые в состоянии непосредственно взаимодействовать с рибосомами, так что только в очень редких случаях их трансляции должен предшествовать процессинг.

У эукариот, напротив, образование зрелой иРНК, кодируемой прерывистым геном, - наиболее сложный процесс из всех видов процессинга, обеспечивающий большое число реакций сплайсинга, обеспечивающих соединение экзонов путем удаления интронов. Все реакции процессинга являются высокоспецифичными, что приводит к образованию зрелых молекул РНК с уникальными 5'- и 3'- концами.
Эндонуклеотические и экзонуклеотические ферменты

Реакции процессинга осуществляются специфическими рибонуклеазами. способными расщеплять фосфодиэфирные связи в молекулах РНК. Как любые другие нуклеазы, рибонуклеазы, участвующие в процессинге разделяют на две класса: экзонуклеазы и эндонуклеазы.

Эндонуклеазы расщепляют определенные связи внутри молекул РНК, что приводит к образованию более коротких фрагментов. Эти ферменты участвуют в реакциях разрезания молекул РНК, в которых нуклеотидные последовательности, соответствующие зрелой РНК, отделяются от концевых последовательностей.

Экзонуклеазы удаляют остатки нуклеотидов с конца молекулы по одному с образованием мононуклеотидов. По способу воздействия на субстрат экзонуклеазы подразделяют на ферменты, действующие случайно или последовательно. Фермент, действующий на РНК-субстрат случайным образом, удаляет концевой нуклеотид из одной молекулы РНК и затем диссоциирует из фермент-субстратного комплексе с РНК. В ходе следующего каталитического акта фермент может атаковать либо ту же самую, либо другую молекулу РНК-субстрата. При последовательном отщеплении нуклеотидов фермент остается связанным с одной и той же РНК и удаляет один нуклеотид за другим с целью подравнивания молекул РНК. Все охарактеризованные к настоящему времени экзонуклеазы подравнивают молекулы РНК за счет удаления избыточного материала, расположенного на 3'- конце. Удаление материала с 5'- конца происходит посредством разрезания с участием эндонуклеаз.

Помимо участия в специфических реакциях созревания рибонуклеазы осуществляют деградацию «избыточной» РНК. К таким «избыточным» молекулам относятся зрелые РНК, которые уже выполнили; свои функции, а также материал, который образовался при разрезании предшественников. Рибонуклеазы, участвующие в таких превращениях, менее, специфичны, чем рибонуклеазы, участвующие в определенных реакциях созревания, поскольку их функция заключается в полном разрушении РНК, а не в образовании специфических концов.

В действительности рибонуклеазы сильно различаются по своей субстратной специфичности. Вместе с тем не описана ни одна эндорибонуклеаза, которая бы действовала на характерные последовательности из нескольких нуклеотидов. По этой причине их нельзя рассматривать как аналоги рестриктаз, узнающих именно специфические последовательности в ДНК, подлежащие расщеплению. Многие эндорибонуклеазы обладают некоторой небольшой специфичностью в том смысле, что они расщепляют фосфодиэфирные связи в местах расположения определенных оснований. Однако они значительно более специфичны по отношению к конформации РНК-субстрата. Таким образом, характерной особенностью эндорибонуклеаз является не то, что они узнают определенные последовательности, как рестриктазы, а проявляют специфичность по отношению к конформации молекулы РНК, т.е. к тем участкам, которые образуют вторичные и третичные структуры, подобные шпилькам структурам в целом, характерным, например, для тРНК.

Нуклеазы различаются как по своей ферментативной активности, так и субстратной специфичности. Фосфодиэфирные связи, соединяющие два нуклеотида, могут быть расщеплены с любой стороны от фосфатной группы.

При разрыве связи по одну сторону от фосфатной группы образуются 3'- гидроксильный и 5'- фосфатный концы. Внесение разрыва по другую сторону фосфатной группы приводит к образованию 3'-фосфатных и 5'- гидроксильных концов.

К числу эндонуклеаз, расщепляющих молекулы РНК с формированием 3'- фосфатных и 5'-гидроксильных концов относятся панкреатическая рибонуклеаза и рибонуклеаза Т!, получаемая из Aspergillus oryzae. Рибонуклеаза Т1 была обнаружена также в клетках других грибов и бактерий.

Панкреатическая рибонуклеаза А специфически гидролизует межнуклеотидные связи предпочтительно в однонитевых РНК по пиримидиновым основаниям. Конечными продуктами гидролиза являются пиримидиновые нуклеозид -3'- фосфаты и олигонуклеотиды. содержащие 5'-ОН- и 3'- фосфатную группу.

Рибонуклеаза А образована одной полипептидной цепью, содержащей 124 аминокислотных остатка, а ее молекулярная масса равна 13 600 дальтон. РНКаза А является первым ферментом, для которого была установлена первичная структура. Кроме того, в 1969 году методом твердофазного синтеза на полимерном нерастворимом носителе (микропористый хлорметилированный сополимер стирола и дивинилбензола) Роберт Меррифилд осуществил полный химический синтез каталитически активного фермента. Результаты данной работы со всей очевидностью продемонстрировали, что именно последовательность аминокислот определяет трехмерную структуру белка. В определенных условиях РНКаза А может быть фрагментирована под действием субтилизина, расщепляющего пептидную связь Ala -20 - Ser-21. Образующиеся фрагменты были названы S-пептидом (остатки 1-20) и S-белком (остатки 21-124). Полученные фрагменты за счет-нековалентных взаимодействий образуют комплекс, названный РНКазой S. Этот комплекс обладает в" отличие от изолированных фрагментов практически полной каталитической активностью.

Рибонуклеаза Т1 из Aspergillus oryzae осуществляет расщепление межнуклеотидных связей в одноцепочечных РНК по гуаниновым остатком, образуя гуанозин -3'- фосфаты и олигонуклеотиды, имеющие на 5'- конце гидроксильную группу, а на 3'- концах - гуанозин-3'- фосфаты.

Рибонуклеаза Т2 из A. oryzae при длительном гидролизе РНК расщепляет ее полностью до нуклеозид - 3'- фосфатов. При частичном расщеплении РНК образуются преимущественно фрагменты, содержащие на 3'- концах аденозин-3'- фосфаты.

Среди других ферментов, расщепляющих РНК, следует упомянуть рибонуклеазу III из Е. coli, проявляющую абсолютную специфичность к двухцепочечным полирибонуклеотидам. Фермент дает олигонуклеотиды, оканчивающиеся 3'- фосфатом.

До того момента как появились современные методы секвенирования нуклеиновых кислот, указанные выше ферменты использовали для расщепления РНК до олигонуклеотидов различной длины с целью определения нуклеотидной последовательности блочным способом. Наиболее широкое распространение приобрели методы неполных расщеплений РНК маркируют путем введение радиоактивной метки (обычно это ³²Р) с помощью полинуклеотидкиназы для 5'-конца или РНК-лигазы для З'-конца. Затем меченую РНК разделяют на четыре порции и каждою порцию подвергают неполному расщеплению одной из специфических рибонуклеаз. Продукты гидролиза в каждой порции, представляющимися последовательностями, наносят в лунки полиакриламидного геля, подвергают электрофоретическому разделению и радиоавтографируют. Последовательность нуклеотидов в РНК читают непосредственно с радиоавтографа, поскольку каждая из четырех дорожек соответствует набору олигонуклеотидов, полученных при расщеплении молекулы по определенному остатку. Недостатком метода является малая специфичность рибонуклеаз к определенному типу оснований (например, рибонуклеаза Т2), а также зависимость скорости расщепления от типа основания. Вследствие этого приходится использовать набор различных рибонуклеаз с перекрывающейся специфичностью. Именно в силу низкой специфичности описанных выше рибонуклеаз есть все основания полагать, что данные ферменты ответственны за деградацию РНК in vivo.

В естественном состоянии все молекулы РНК полярны: на 3'- конце находится гидроксильная группа, а 5'- конец фосфорилирован (на этом конце, в зависимости от типа модификации, может находиться трифосфат. монофосфат или даже «кэп»). Ферменты, участвующие в процессинге РНК, образуют такие же концы. Таким образом, воздействие на РНК всех ферментов процессинга, как разрезающих молекулу изнутри, так и отщепляющих концевые нуклеотиды, приводит к образованию окончательных 5'- фосфатных и 3'- гидроксильных концов.